Séquence de deuxième trimestre de l année de terminale STL Biotechnologies

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Activités technologiques Séquence de deuxième trimestre de l année de terminale STL Biotechnologies Caractérisation d un microorganisme producteur de bêta-galactosidase, Production, extraction (purification)
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Activités technologiques Séquence de deuxième trimestre de l année de terminale STL Biotechnologies Caractérisation d un microorganisme producteur de bêta-galactosidase, Production, extraction (purification) de l enzyme, Étude de l activité enzymatique de l extrait obtenu. Compétences visées : - Exploiter des ressources documentaires et des activités expérimentales pour présenter les propriétés structurales et catalytiques des enzymes (bêta-galactosidase) ; - Identifier des microorganismes (producteurs de bêta-galactosidase) ; - Observer et décrire les caractéristiques morphologiques et microscopiques des moisissures ; - Mettre en œuvre une identification de bactérie par une galerie miniaturisée ; - Mettre en évidence qualitativement une biomolécule (test onpg) ; - Mettre en œuvre un suivi de croissance d une bactérie (E.coli) ; - Utiliser une technique unitaire de fractionnement pour extraire ou purifier des biomolécules (centrifugation) ; - Effectuer une purification d enzyme et établir le tableau de suivi ; - Déterminer la vitesse initiale d une réaction enzymatique en suivant le produit formé (onpg onp). onpg 1 Contexte mobilisateur : Thème : santé / bioindustries : production de lait à teneur réduite en lactose (personnes alactasiques) Situation déclenchante pour une mise en activité des élèves :étiquette du lait Viva de Candia étiquette du lait «matin léger» de Lactel Analyser les deux étiquettes pour mettre en évidence le lien entre l argument commercial et la composition du lait. onpg 2 Questionnaire et recherche de ressources documentaires pour la mise en action des élèves - Qu est-ce que la lactase? (enzyme : protéine ; recherche d images de molécules sur internet ; substrat et produits : images de molécules sur internet, en lien avec CBSV). - Quel est le rôle de la lactase dans la digestion chez l'homme? Quel est le rôle de la lactase comme additif dans certains laits? - Comment est produite la lactase, quelles sont les conditions de production de cette enzyme chez les bactéries (induction, T C, ph )? - Comment mettre en évidence l activité bêta-galactosidase 1 d un microorganisme au laboratoire? Planification et contenus de la séquence Séance 1 La lactase : rôle, production 2 Étude de microorganismes producteurs de β- galactosidase Activités technologiques 1 Exploitation de ressources documentaires 2 Examen macro et micro de souches moisissures, levures, bactéries, repiquage sur milieu lactosé, Mise en œuvre du test onpg Organisation temporelle 2h, classe entière Recherche documentaire 2h + 2h : Manipulations Formes d animation / posture enseignant Travail en groupe / accompagnement Autonomie détermination du Mode opératoire pour le test onpg (principe, réalisation) Accompagnement Organisation spatiale et logistique CDI Accès internet Laboratoire Microscope Souches sur milieu solide lactosé Réactif onpg Bain thermostaté Ressources pédagogiques TICE (recherche doc) lien CBSV (molécules) Questionnaire Analyse étiquettes Questionnaire complété en séance 1 Fiches Compétences de première (µorg) Supports théoriques Induction Trace écrite, restitution Présentation orale : réponses au questionnaire Mise en commun Mode opératoire rédigé pour le test onpg Résultats obtenus pour les différentes souches testées Réinvestissement Collecte d infos qui seront utilisées dans la séance 2 Vérification ciblée d un caractère 1 Ce terme ou celui de bêta- galactisodasique sera indifféremment désigné par «bêta-gal» ou «β-gal». onpg 3 3 Vérification de l identité d un microorganisme producteur de β- galactosidase 4 Production de β- galactosidase par E.coli 5 Récupération de l enzyme produite par E. coli 6 Étude de l activité enzymatique de l extrait obtenu comparé à une solution commerciale de lactase 3 Mise en évidence de caractères morphologiques, micro et macro, culturaux et métaboliques de E.coli et Aspergillus 4 Suivi de croissance E.coli productrice de β-galactosidase 5 Extraction et purification de l enzyme produite par de l enzyme produite par E. coli 6 Détermination de l activité enzymatique de l extrait obtenu et de la solution du commerce Manipulation 1h travail préliminaire : galerie bactérie et moisissure 3h + 2h : identification Manipulations 4h : préparation inoculum, mesure absorbance toutes les 15 min Acquisition de concepts Manipulations 1h : travail préliminaire : rôle des étapes? activité documentaire 3h : mise en œuvre de l extraction Manipulation 2 séances de 3h Détermination Vi Étude cinétique (K M et Vimax) Travail binôme (mode op API) Mise en œuvre individuelle ou en binôme Accompagnement Présentation par le professeur puis accompagnement Travail binôme recherche documentaire Groupe d atelier Groupe d atelier Présentation de la manip puis accompagnement Laboratoire Microscope Bleu coton Sabouraud API 20 E Bouillon LB lactosé bain à agitation thermostaté Spectro + cuves Salle accès internet Labo : bouillon E. coli 48h, centrifugeuse, tampon P, (NH 4 ) 2 SO 4, ou sonication onpg, spectro, tampon P solution d enzyme séance 5 et commerciale Notice technique API 20 E Support : schémas et/ou photo : «identification des moisissures» Méthode d identification vue en classe de première Support théorique principe croissance : phases, paramètres, effecteurs Questionnaire TICE : Annexe 1 purif. CAPET 2005 Mode opératoire adapté au labo Support théorique «enzymologie» Mode opératoire de l activité technologique Mode opératoire à partir de la notice technique CR identification moisissure & bactérie Courbe de croissance tracée au cours du suivi Doc réponse questionnaire à rendre au prof (CAPET 2005) Mise en commun Vi, K M et Vimax des deux préparations Compterendu : comparaison des deux activités Choix dirigé d une souche pour la séance 4 Conservation culture de E.coli avec β-gal (métabolite primaire) pour séance 5 Les réponses au questionnaire : deviennent support de cours «purification d enzyme» Récupération de l extrait Commenter et critiquer les résultats obtenus avec les 2 préparations onpg 4 Évaluation formative - Séance 2 Ré-investissement des compétences acquises en première (utilisation du microscope, colorations usuelles, isolement) - Séance 3 Vérification d identité des deux microorganismes producteurs de bêta-galactosidase : repérage des acquis de la démarche et des difficultés en vue d une remédiation - Séance 4 Évaluation des compétences liées à la manipulation aseptique lors des prélèvements réguliers au cours de la croissance - Séance 5 Validation des réponses au questionnaire après mise en commun - Séance 6 Compte-rendu : analyse comparée des résultats et contribution des binômes à l élaboration de l organigramme final concernant la thématique «bêta-galactosidase» Mise en valeur des productions : Diagramme des manipulations et des résultats associés depuis le début avec mise en commun (présentation par groupes) et échange pour constitution d un document final qui pourra être publié sur le site du lycée. onpg 5 Documents ressources possibles pour la recherche documentaire (séance 1) Source : course1.winona.edu, 02/05/12 source : www2.ac-lyon.fr, 02/05/12 onpg 6 Source : cours-de-biochimie.fr, 02/05/12 onpg 7 The β-galactosidase Assay (source : The basis of this assay is the biological activity of the enzyme: in this case, cleavage of the bond between the two sugars found in a family of disaccharides known as β-galactosides. Because it has β-galactosidase, E. coli is able to utilize lactose, the sugar found in milk, as an energy source. As a result of cleaving lactose, two monosaccharides are produced that can then be metabolized to produce energy through glycolysis and the citric acid cycle. When β- galactosidase cleaves lactose, its natural substrate in E. coli, the reaction looks like this: β-galactosidase lactose = glucose + galactose The natural products of this reaction are colorless and not readily detectable. Therefore, an assay system has been developed in which a synthetic sugar is cleaved, producing a colored product that absorbs light in the visible range. The artificial sugar is o-nitrophenyl- β-galactoside (onpg). The product, o- nitrophenol (onp), is yellow and can be quantitated spectrophotometrically at 420 nm. β -galactosidase o-nitrophenyl- β-galactoside = o-nitrophenol (ONP) + galactose When more enzyme is present, more product will be formed and more yellow color will be seen. Enzyme assays must be performed at temperatures at which the enzyme is active and, for the sake of comparison, must always be performed at the same temperature; in this case, 37 C. Since measuring the activity of the enzyme is dependent on having an ample supply of substrate, you want the substrate to always be present in excess so that it is not limiting your ability to measure the enzyme. Therefore, if the assay tubes turn bright yellow immediately, the substrate is being used too quickly and the assay will not be accurate. Because the reaction continues as long there is substrate available, you will need to stop the reaction after a designated time in order to measure the absorbance consistently. This is done by adding NaCO 3, a strong base (ph 10-11) that denatures the enzyme and renders it inactive. onpg 8 Reactions catalyzed by β-galactosidase OVERVIEW OF ASSAY (source : ftp://news.ttm.bg/incoming/siridjen/.../assay%20for%20galactosidase.doc) Using disposable glass tubes for these assays, you will add µl of sample to 1 ml of Z buffer, a buffer in which β-galactosidase has full activity. The Z buffer containing the sample and the onpg substrate will then be separately pre-incubated to 37 C. The enzymatic reaction will begin as soon as you add the substrate to the samples. After you incubate the tubes for a sufficient length of time, you will terminate the reaction in all the tubes, using the STOP solution (NaCO 3 ). Read the sample absorbance on the spectrophotometer after transferring the contents of the tube to a plastic cuvette. 1. Make a Flow Chart. Begin your preparations by making a flow chart or outline that details exactly what you are going to do in this assay. Save this flow chart as you did for the Bradford Assay and modify it as you refine and streamline your technique. 2. Turn On The Spec. Turn on the spectrophotometer and set the wavelength to 420 nm. 3. Dilute The Sample(s). In your first assay you will be using a sample of β-galactosidase provided by your instructor. It will be your job to determine the activity of this sample. (After starting the purification, you will be using your own samples.) Prepare a few dilutions of this sample. What will be the diluent? 4. Add The Samples and Control To Z Buffer. Add µl of the diluted sample(s) to 1 ml of Z buffer. As always, remember to write down how much sample you used. onpg 9 5. Prepare a control tube by adding a volume of buffer that is equal to the volume of sample used in step 4 (10-50 µl) to a tube containing 1 ml of Z buffer. This functions as a control for the spontaneous hydrolysis of your substrate, onpg, and will serve as your calibration blank for the spectrophotometer. 6. Equilibrate. Equilibrate the samples to be assayed to 37 C. Make sure the onpg (4 mg/ml in 0.1 M sodium phosphate buffer ph 7.5) is also at 37 C. Prepare fresh onpg solution each day. 7. Begin The Reaction. Add 0.2 ml of onpg to each tube and record the time. 8. Incubate. Incubate the samples at 37 C until yellow color appears. The color change should take at least 10 minutes but may take longer to result in an absorbance of 0.3 to 0.9. A very rapid color change (1-5 minutes) indicates that there is too much activity to measure accurately. Such samples should be repeated at a higher dilution. Samples containing low concentrations of β-galactosidase may take significantly longer than 10 minutes to become yellow. (Why is a rapid color change (0.5 O.D. in 2 minutes) not accurate?) 9. Stop The Reaction. Add 0.5 ml of 1 M NaC0 3 (Stop Solution) to terminate the reaction and record the time. 10. Read The Samples. Transfer the samples to plastic cuvettes and read the A 420 against the blank. 11. Determine The Enzyme Activity : Calculate the enzyme activity present in your sample using the formula shown below : activity!=! A 420!! 0,380!units of!-galactosidase t min!at!37 C 12. One unit is the amount of enzyme that will hydrolyze 10-6 moles/minute of onpg at 37 C and in the above equation is the constant used to convert the A 420 reading into these units. This constant is a function of the molar extinction coefficient for ONP+ that, under these conditions, is 4500 M -1 cm -1. What is a molar extinction coefficient? onpg 10
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